Snelle detectie van verspreiding van een ziekte of plaag voorkomt mogelijk problemen met de export van teeltmateriaal. Wat als men op locatie direct het teeltmateriaal kan toetsen op ziekteverwekkers? In het Topsector ‘On-site en Barcoding’ verkenden brancheorganisaties, het bedrijfsleven, Wageningen University & Research en Naktuinbouw de mogelijkheden.
Het toenemende internationale transport van plantaardige producten en klimaatverandering kan problemen veroorzaken voor de Nederlandse tuinbouwsector. De kans op verspreiding van ziekteverwekkers (pathogenen) is dan immers groter. Het identificeren en detecteren van (plant)pathogenen met snelle, nauwkeurige en gevoelige methoden direct in de productieketen op locatie is essentieel. Vroege detectie maakt tijdige actie mogelijk. Om zo verspreiding van de ziekte of vertraging en beperkingen in de export van plantgoed en zaden te voorkomen.
Testen op locatie
Voor een groot aantal plantpathogenen zijn er veel detectiemethoden. De uitdaging in dit project was niet alleen het testen op locatie (on-site) voor deze organismen. Ook was er behoefte aan het testen op meerdere organismen in één reactie. In het PPS-project ‘On-site en Barcoding’ onderzochten diverse partners of het mogelijk is snelle on-site testen te maken. Het project bestond uit drie werkpakketten en werd onlangs afgerond.
Snel DNA en RNA beschikbaar stellen
Hoe kan men nu zo snel en efficiënt mogelijk pathogeen-DNA en -RNA uit en blad beschikbaar maken voor de vermenigvuldiging (amplificatie) met PCR of een andere moleculaire methode? Dit was de onderzoeksvraag in Werkpakket 1. Hiervoor zijn protocollen opgesteld die nu beschikbaar zijn.
Een extra mogelijkheid is het gebruik van zogenoemde FTA cards. Dit zijn papieren kaartjes waarop bladmateriaal kan worden gedrukt. Het DNA en RNA komt dan vrij en stabiliseert zich in de poriën van het papier. Na indroging kan men het kaartje veilig per post versturen naar een laboratorium voor verdere (moleculaire) analyse. In het project zijn voor verschillende pathogenen voorbeelden uitgewerkt.
LAMP-testen
In Werkpakket 2 ontwikkelden de onderzoekers voor verschillende ziekteverwekkers zogenoemde LAMP-testen. Dit zijn detectietoetsen, vergelijkbaar met de PCR-methode voor COVID-19. In een LAMP-test wordt DNA of RNA van de ziekteverwekker vermenigvuldigd op één temperatuur (65oC). De onderzoekers voerden deze reactie uit in een apparaat Genie II of Genie III. Deze kan de vermenigvuldiging real-time volgen door fluorescentie. Door het gewicht van circa 2 kilo kan de reactie on-site worden uitgevoerd. Dit levert een snelheidsvoordeel op.
De toename van de fluorescentie is te zien op de afbeelding op de website van Naktuinbouw. Na 11 minuten is er al een positief signaal. Het is ook mogelijk deze vermenigvuldiging met het blote oog te zien met behulp van een kleuromslag. Echter, hierbij was alleen het resultaat aan het einde van de reactie te zien.
Testen en evalueren
De LAMP-testen zijn ontwikkeld en geëvalueerd voor ToBRFV, TMV, MNSV, TSWV, PVY, Xanthomonas fragariae, Fusarium solani, F. oxysporum, F. proliferatum en Verticillium dahliae. Hierbij werd symptomatisch plantmateriaal getest. Bij materiaal zonder symptomen vormt de juiste bemonstering een groot vraagstuk. Er is ook gekeken om het aantal LAMP-reacties voor verschillende ziekteverwekkers te combineren (multiplex). De onderzoekers voerden experimenten uit met microfluidics 3D geprinte chips. Echter, de bruikbaarheid geeft nog problemen.
Meerdere virussen tegelijkertijd
In het derde werkpakket (WP3) experimenteerden de onderzoekers om zes tobamovirussen tegelijkertijd in een bladmonster te kunnen meten. Het ging om deze virussen: CGMMV, PPMoV, TMV, ToBRFV, ToMMV en ToMV. Hiervoor wordt een nieuw type sequentie-apparaat ingezet om de aanwezigheid van een stukje RNA van de zes tobamovirussen in een bladmonster te bepalen en te identificeren. Dit apparaat is de MinION. Oxford Nanopore Technologies (ONT) heeft sinds 2005 de zogenaamde Nanopore sequencing methode ontwikkeld. De MinIon is het kleinste draagbare apparaat voor deze methode.
Analyse met de MinIon
De uitkomst is een protocol om de zes tobamovirussen tegelijkertijd te kunnen detecteren. Vier monsters (FTA cards gespot met geïnfecteerde bladeren) van East West Seed (EWS) werden geanalyseerd.
Tabel 1: Uitslagen van de MinION analyse op een 4tal FTA card monsters van EWS. De getallen geven het aantal sequenties weer wat gevonden is voor een bepaald tobamovirus.
In de vier monsters van EWS konden de tobamovirussen goed worden aangetoond (Tabel 1). Twee monsters (EWS-1 en EWS-4) bevatten meerdere tobamovirussen. De conclusie: Nanopore-sequencing (MinION) heeft een groot potentieel om ziekteverwekkers en plagen in complexe gemeenschappen op te sporen.
Workshops om kennis te delen
Het delen van de ontwikkelde kennis met telers en andere belanghebbenden is een belangrijk onderdeel van het project. Hiervoor waren er vijf workshops in binnen- en buitenland.
Bron: Naktuinbouw